Ирина Спивак - Репликация ДНК: учебное пособие

• Название: Репликация ДНК: учебное пособие
• Автор: Ирина Спивак
• Жанр: Биология
• Год: 2011

Учебное пособие соответствует государственному образовательному стандарту дисциплин «Экология» и «Физико-химические основы цитологии» подготовки бакалавров по направлению 140400 «Техническая физика».

В пособии описываются проблемы репликации ДНК. Излагаются современные представления о строении хромосом, координации в течение клеточного цикла процессов ДНК-метаболизма, а также описываются участвующие в этих процессах белки и рассматриваются механизмы, отвечающие за сохранение генетической стабильности организмов.

Предназначено для студентов дневной, очно-заочной и заочной форм обучения, изучающих дисциплины «Экология» и «Физико-химические основы цитологии» в рамках подготовки бакалавров по направлению 140400 «Техническая физика».

---

РоlI и присущие ей экзонуклеазные активности играют очень большую роль в репликации и репарации хромосомной ДНК Е. соli. 3’-5'-экзонуклеазная активность обеспечивает контроль за присоединением каждого нуклеотида и удаление ошибочных нуклеотидов вновь синтезированной цепи. Если эта активность подавлена в результате каких-то мутаций в гене, кодирующем РоlI, то при репликации генома часто происходят мутации – замены оснований.

Способность ДНК-полимеразы удлинять 3'-конец нити, спаренной с матричной нитью, позволяет ей заполнять пробелы между сегментами отстающей нити. РоlI удлиняет фрагменты Оказаки с 3'-концов и удаляет рибонуклеотиды праймера, с которых начинаются 5'-концы соседних фрагментов, что является необходимой предпосылкой для формирования непрерывной отстающей цепи. Поскольку РоlI способна удлинять 3'-конец одной из цепей в месте разрыва в двунитевой ДНК и удалять нуклеотиды с 5'-конца того же разрыва (процесс, называемый ник-трансляцией), этот фермент играет ключевую роль в репарации поврежденной ДНК. Ник-трансляция широко используется in vitro для синтеза радиоактивно меченой ДНК.

У Е. соli имеются и две другие ДНК-полимеразы, но они присутствуют в клетке в меньших количествах. РоlII присоединяет нуклеотиды значительно менее эффективно, чем Ро11, и не обладает 5'-З'-экзонуклеазной активностью. Следовательно, РоlII может заполнять пробелы между фрагментами ДНК, спаренными с матричной цепью, но не способна отщеплять РНК-нуклеотиды от фрагментов Оказаки или осуществлять ник-трансляцию. Роль РоlII в репликации и сохранении хромосомной ДНК Е. соli до настоящего момента неясна. Вероятно, она может участвовать в восстановлении синтеза ДНК после повреждения и остановки вилки репликации. Такой процесс принято называть ресинтезом.

PolIII-холофермент – это ключевой фермент, ответственный за репликацию хромосомной ДНК Е. соli. В каждой клетке содержится только 10–20 копий PolIII – холофермента, но именно он является основным компонентом мультиферментного полимеразного комплекса, инициирующего формирование репликативных вилок в точках начала репликации, участвующего в элонгации лидирующей цепи в вилке и удлиняющего РНК-праймеры с образованием фрагментов Оказаки. Так как PolIII – холофермент не обладает 5'-3'-экзонуклеазной активностью, для репликации отстающей цепи необходимо участие РоlI, чтобы произошло удлинение продукта, образовавшегося при участии PolIII, и удаление РНК-праймеров на 5'-конце фрагментов Оказаки.

Методом направленного мутационного анализа обнаружены изменения в полипептидной цепи основного (кор) фермента PolIII, и изучены аминокислотные замены, которые позволяют приписать определенные виды ферментативной активности конкретным субъединицам ферментного комплекса. Так, α-субъединица обладает полимеразной активностью, а ε-субъединица – 3' 5'-экзонуклеазной. Однако комплекс α– и ε-субъединиц обладает значительно более высокой полимеразной и экзонуклеазной активностями, чем каждая из соответствующих субъединиц в отдельности. Функция третьей, θ-субъединицы пока неясна.

Помимо субъединиц, составляющих PolIII – кор, PolIII-холофермент содержит еще семь субъединиц: τ,γ,β,δ,δ’,χ, и ψ. Перечисленные полипепгиды также существуют во множестве копий, так что в результате мол. масса полимеразного комплекса составляет примерно 103 кДа. Роль β-субъединицы заключается в том, чтобы свести к минимуму вероятность отделения фермента от матрицы до завершения процесса копирования, то есть работает как «зажим». Субъединица τ является фактором димеризации репликативных холоферментов. Точная же функция других субъединиц неизвестна. Вполне возможно, что PolIII-холофермент существует в двух формах, каждая из которых содержит определенный набор вспомогательных субъединиц, придающих ферменту определенные свойства. В одной форме фермент катализирует синтез непрерывной ведущей цепи, а в другой – прерывистой отстающей.

PolIII-холофермент катализирует же реакции синтеза, что и PolI, но работает примерно в 60 раз быстрее. Более того, PolIII-холофермент обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает более высокую эффективность копирования. PolIII-холофермент может связываться и с другими белками, увеличивая эффективность процесса копирования благодаря координации некоторых важных ферментативных этапов репликации. На этом более высоком уровне организации в комплексы могут включаться белки, расплетающие спираль ДНК в точках начала репликации и в репликативных вилках (геликазы), инициирующие образование праймерных РНК (праймазы), обеспечивающие последовательное наращивание цепей ДНК, терминирующие процесс репликации и разделяющие дочерние спирали ДНК.

ДНК-полимеразы, синтезируемые другими бактериями и многими бактериофагами, различаются по своим физической структуре и свойствам. Тем не менее, катализируемые ими реакции практически идентичны реакциям, изученным у Е. соli. У всех ДНК-полимераз есть корректирующая 3'-5'-экзонуклеаза, однако 5'-3'-экзонуклеаза у большинства ферментов отсутствует. Например, ДНК-полимераза фага Т4 может осуществлять 3'-5'-экзонуклеазную реакцию и корректировать ошибки репликации, но не способна катализировать 5'– З'-экзонуклеазную реакцию и поэтому не может обеспечить ник-трансляцию. При репликации ДНК фага Т4 5'-3'-экзонуклеазную реакцию удаления РНК-праймеров перед объединением фрагментов Оказаки катализирует другой кодируемый фагом белок. В процессе прерывистого синтеза отстающих нитей и репарации повреждений ДНК фага Т4 этот фермент работает согласованно с фаговой ДНК-полимеразой. Некоторые вирусы животных (например, герпесвирус, вирус коровьей оспы и вирус гепатита) индуцируют синтез особых полимераз для репликации своих геномов.

Другие вирусы образуют белки, которые стимулируют системы репликации клеточной ДНК или участвуют в репликации вирусной ДНК. Например, паповавирусы синтезируют белки, необходимые для инициации репликации. Аденовирусы человека кодируют белки, «запускающие» инициацию синтеза обеих цепей линейной вирусной ДНК. Они продуцируют также особые ДНК-связывающие белки, облегчающие репликацию.

4.3.1.2. ДНК-полимеразы эукариот

В эукариотических клетках идентифицировано множество ДНК-полимераз, но их физические и функциональные свойства изучены менее детально, чем у соответствующих ферментов прокариот.

Таблица 3

ДНК-полимеразы эукариот

Точная пространственная структура, определенная с помощью рентгеноструктурного анализа, известна лишь для одной ДНК-полимеразы эукариот – полимеразы β-типа, которая заметно отличается по строению от других эукариотических ДНК-полимераз. Сводные данные об основных полимеразах эукариот приведены в таблице 3.

4.3.1.3. ДНК-полимераза α – праймаза

В клетках эукариот синтез ДНК происходит, в основном, в специфических плотных структурах ("репликативных фабриках"), присоединенных к диффузному ядерному матриксу. Предполагается, что в молекулярной организации ядерного матрикса играют некоторую роль фосфолипиды и что ДНК связана с ядерным скелетом гидрофобными взаимодействиями. "Репликативные фабрики" или 21S репликативные комплексы, включают в себя группу ферментов, состоящую не менее чем из 30 белков с молекулярной массой от 15 до 300 кДа, и содержат помимо ДНК-полимеразы α – праймазы еще и 3'-5'-экзонуклеазу, ДНК-лигазу I, РНКазу Н, ДНК-топоизомеразу I, ДНК-геликазу, РСNA и ряд других факторов. Также этот комплекс содержит RРА, специфически взаимодействующий с субъединицей р48 комплекса полимераза-праймаза. Значительный запас ДНК-полимеразы α накапливается в яйцеклетках иглокожих, амфибий, костистых рыб и дрозофилы для обеспечения интенсивной репликации ядерной ДНК в ходе раннего развития.

Как правило, ДНК-полимеразы α не обладают корректорской 3'—5'-экзонуклеазной активностью. Однако в каталитической субъединице 182 кДа ДНК-полимеразы α дрозофилы обнаружена 3'—5'-экзонуклеаза, проявляющая активность только при диссоциации субъединицы 73 кДа.

Мультибелковая форма ДНК-полимеразы α содержит также белок, который связывает динуклеотид диаденозинтетрафосфат (Ар4А). Предполагается, что Ар4А участвует в репликации ДНК и клеточном делении. Имеются данные о способности ДНК-полимеразы α использовать Ар4А в качестве праймера. Однако участие Ар4А в качестве праймера in vivo маловероятно, скорее он используется как эффектор. Интересно, что триптофанил-тРНК-синтетаза, синтезирующая этот динуклеотид, находится в том же мултибелковом комплексе.

Обычно комплекс праймаза-полимераза α состоит из четырех субъединиц: большой субъединицы с молекулярной массой 180 кДа, или семейства полипептидов с размерами от 140 до 160 кДа; субъединицы с молекулярной массой около 68–70 кДа и двух малых субъединиц с молекулярными массами 54–58 и 46–50 кДа. Субъединица р180 отвечает за полимеразную функцию. С двумя малыми субъединицами связана праймазная активность. При этом субъединица 48 кДа является каталитической и непосредственно осуществляет праймирование ДНК, а субъединица 58 кДа участвует в связывании инициирующего пуринового нуклеотида и присоединении субъединицы р48 к ДНК-полимеразе α. Она также влияет на скорость полимеризации и стабильность продукта, синтезируемого субъединицей 48 кДа. р58 также облегчает проникновение р48 из цитоплазмы в ядро. Субъединица р180 непосредственно взаимодействует с р58.